DIN EN ISO 15216-2:2019-12

In diesem Dokument wird ein Verfahren zum Nachweis von HAV und Noroviren der Genogruppen I (GI) und II (GII) in Untersuchungsproben von Lebensmitteln oder Lebensmitteloberflächen beschrieben. Nach der Freisetzung der Viren aus der Untersuchungsprobe wird die virale RNA durch Aufschluss des Viruskapsids mit Guanidinthiocyanat und Adsorption an Silica(-Partikeln) extrahiert. Die Zielsequenzen innerhalb der viralen RNA werden amplifiziert und mittels Real-time-RT-PCR nachgewiesen. Hepatitis-A-Viren (HAV) und Noroviren sind wichtige Erreger von lebensmittelbedingten Viruserkrankungen beim Menschen. Bislang gibt es keine Routineverfahren zur Kultivierung von Noroviren und die Kultivierungsverfahren von HAV eignen sich nicht zur Routineanwendung auf Lebensmittelmatrices. Der Nachweis beruht daher auf molekularbiologischen Verfahren unter Anwendung der Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT PCR). Da viele Lebensmittelmatrices Substanzen enthalten, die sich hemmend auf die RT PCR auswirken, ist es notwendig, ein Extraktionsverfahren anzuwenden, mit dem hochreine gebrauchstaugliche RNA Extrakte erhalten werden. Von Oberflächen werden die Viren mit einem Tupfer abgenommen. Bei weichem Obst sowie Blatt-, Stängel- und Zwiebelgemüse erfolgt die Virusextraktion durch Elution unter Rühren, gefolgt von der Fällung mit PEG/NaCl. Bei in Flaschen abgefülltem Trinkwasser erfolgt eine Adsorption und Elution der Viren unter Verwendung positiv geladener Membranen und anschließender Anreicherung mittels Ultrafiltration. Bei zweischaligen Weichtieren werden die Viren aus dem Gewebe der Verdauungsdrüsen durch Behandlung mit einer Proteinase-K-Lösung isoliert. Bei allen Matrices, die nicht in diesem Dokument aufgeführt sind, ist es notwendig, dieses Verfahren zu validieren. Für sämtliche Matrices wird ein einheitliches RNA-Extraktionsverfahren verwendet, das auf dem Aufschluss des Viruskapsids mittels chaotroper Reagenzien und anschließender Adsorption der Nukleinsäuren an eine Silica Matrix beruht. Bei der Real-time-RT-PCR wird die Amplifikation während des Real-time-RT-PCR-Zyklus durch Messung der Anregung von fluoreszenzmarkierten Molekülen verfolgt. Bei der Real-time-RT-PCR mit Hydrolysesonden wird eine sequenzspezifische, mit Fluoreszenzmarkern gekoppelte Nukleotidsonde verwendet, die ebenfalls eine simultane Bestätigung der Zieltemplates ermöglicht. Diese Modifikationen erhöhen Empfindlichkeit und Spezifität des Real-time-RT-PCR-Verfahrens und erübrigen zusätzliche Schritte zur Verifizierung des Amplifikationsergebnisses nach der Real-time-RT-PCR. Aufgrund der Komplexität des Verfahrens ist es notwendig, einen umfassenden Satz von Kontrollen mitzuführen. Das zuständige deutsche Normungsgremium ist der Arbeitsausschuss NA 057-01-06 AA "Mikrobiologie der Lebensmittelkette" des DIN-Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL).